黃曲霉毒素免疫親和柱作為食品、農(nóng)產(chǎn)品及中藥材中真菌毒素檢測的核心前處理工具，其上樣體積的精準控制直接影響檢測結果的準確性。本文結合不同基質(zhì)特性與國家標準要求，系統(tǒng)解析上樣體積的選擇原則及優(yōu)化策略。
 

　　一、核心影響因素與選擇原則

　　1.柱容量與毒素濃度

　　黃曲霉毒素免疫親和柱的柱容量通常以納克（ng）為單位標注，例如某品牌黃曲霉毒素B1專用柱容量為300ng，玉米赤霉烯酮三合一柱容量達2000ng。當樣本中待檢毒素濃度（C）與稀釋倍數(shù)（D）的乘積超過柱容量時，需通過減少上樣體積（V）避免柱體過載，計算公式為：V=柱容量/C×D

　　例如，檢測玉米中黃曲霉毒素B1時，若樣本原始濃度為100μg/kg，經(jīng)10倍稀釋后濃度為10μg/L，使用300ng柱容量的親和柱時，最大上樣體積為30mL（300ng ÷ 10ng/mL）。但實際操作中需預留20%安全余量，建議上樣體積不超過24mL。

　　2.基質(zhì)類型與凈化需求

　?、俑咧净|(zhì)（如堅果、食用油）：需增加乙腈比例至85%并延長均質(zhì)時間至3分鐘，同時減少上樣體積至5mL以避免脂溶性雜質(zhì)堵塞柱體。

　　②高色素基質(zhì)（如發(fā)酵茶、醬油）：提取后加入0.5g石墨化碳黑（GCB）吸附色素，或采用集成除色素填料的多功能親和柱，此時上樣體積可維持10mL。

　?、鄹咚只|(zhì)（如水果、蔬菜）：需減少提取液中的水量，并增加無水*用量至樣品量的2倍，上樣體積建議控制在8mL以內(nèi)。

　　3.檢測方法靈敏度

　　液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）的檢測限可達0.01μg/kg，此時可適當增加上樣體積以提高痕量毒素的捕獲效率；而熒光檢測法（HPLC-FLD）檢測限為0.1μg/kg，上樣體積需嚴格控制在10mL以內(nèi)以避免基質(zhì)干擾。

　　二、典型基質(zhì)上樣體積優(yōu)化案例

　　1.花生樣本：稱取5.00g粉碎樣品，用25mL乙腈-水提取后離心，取10mL上清液加入20mL PBS緩沖液稀釋。使用柱容量≥50ng的親和柱時，理論最大上樣體積為30mL，但實際操作中建議分兩次上樣，每次10mL，以降低柱體壓力并提高回收率。

　　2.中藥材樣本：根據(jù)《中國藥典2020版》要求，稱取15.0g樣品，用75mL甲醇-水（7:3）提取后離心，取15mL濾液稀釋至50mL。使用中藥專用親和柱時，上樣體積需嚴格控制在20mL以內(nèi)，并配合10mL淋洗緩沖液去除水溶性雜質(zhì)。

　　3.乳制品樣本：稱取10g乳粉，用50mL 50℃溫水溶解后離心，取50mL乳液通過親和柱。由于乳制品中黃曲霉毒素M1限制要求嚴格，需采用高靈敏度親和柱，上樣體積建議為20mL，并配合10mL一級水洗滌以去除鹽分。

　　三、操作規(guī)范與風險控制

　　1.流速控制：上樣流速需保持在1滴/秒，避免過快導致結合不充分或柱體干涸。

　　2.交叉污染防控：不同樣本凈化時需更換注射器和接頭，柱子使用后立即用10%次氯酸鈉浸泡處理。

　　3.柱效驗證：每批次實驗需同步進行標準品過柱回收測試，取1mL 10ng/mL黃曲霉毒素B1標準溶液直接上柱，回收率應落在70%-120%范圍內(nèi)。若回收率低于70%，需檢查柱體是否漏液或抗體是否失活。

　　四、總結與建議

　　黃曲霉毒素免疫親和柱的上樣體積需根據(jù)柱容量、基質(zhì)特性及檢測方法綜合確定，核心原則為：“高濃度低體積，低濃度高體積；復雜基質(zhì)減體積，簡單基質(zhì)增體積”。例如，檢測高污染風險的花生樣本時，建議采用“小體積（5-10mL）+高稀釋倍數(shù)（10倍）”策略；而檢測低污染風險的玉米樣本時，可采用“大體積（15-20mL）+低稀釋倍數(shù)（5倍）”策略以提升效率。實際操作中需嚴格遵循說明書要求，并通過預實驗驗證最佳條件。